《Science Advances》：3D打印生物活性纤维增强水凝胶助力肌腱再生

时间：2024-05-16 08:54 来源：EngineeringForLife 作者：admin 阅读：次

肌腱连接处（MTJ）是位于肌肉和肌腱交界处的一种复杂而特殊的组织，负责将力量从收缩的骨骼肌通过肌腱传递到骨骼。作为肌肉和肌腱的交界处，MTJ 在日常运动或锻炼中的重复负荷下承受着集中的机械应力，因此，MTJ 的损伤非常普遍。据报道，28% 的肌肉-肌腱-骨骼复合体损伤发生在 MTJ，其风险在肌肉、肌腱、肌肉-肌腱界面和肌腱-骨骼界面损伤中位居第二。目前临床上治疗 MTJ 损伤的方法包括非甾体抗炎药和物理疗法等保守疗法，以及使用各种缝合技术进行手术干预。然而，其有效性受到以下几个方面的限制：(i)瘢痕组织的形成导致机械强度不足，导致治疗后复发率较高；(ii)MTJ 损伤处或附近的缝合切口，经常导致 MTJ 重建失败；(iii)大面积 MTJ 缺损的修复具有挑战性，尤其是在肌肉和肌腱损伤后回缩的情况下。因此，目前的干预措施无法同时促进 MTJ 的结构和功能修复，因此有必要开发前景广阔的高质量 MTJ 再生策略。
来自南京医科大学的姚庆强团队与来自东南大学的张薇等团队合作开发了一种含有间充质干细胞和 Klotho 的3D打印生物活性纤维增强水凝胶，用于 MTJ 的结构和功能再生。在大鼠MTJ缺损模型中，生物活性纤维增强水凝胶促进了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的结构恢复，并增强了损伤MTJ的功能恢复。体内蛋白质组学和体外细胞培养阐明了生物活性纤维增强水凝胶通过调节氧化应激和炎症反应的再生机制，从而设计出一种优化的微环境来支持移植间充质干细胞的存活和分化，并维持 MTJ 组织内常驻细胞（包括肌腱/肌肉细胞和巨噬细胞）的功能表型。这种策略为治疗 MTJ 损伤提供了一种前景广阔的方法。相关工作以题为“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的文章发表在2024年04月24日的国际顶级期刊《Science Advances》。

1. 创新型研究内容

本研究开发了一种3D打印纤维增强多功能水凝胶，为MTJ的结构和功能再生提供足够的机械支持和定制合适的微环境（图1A）。在这种生物活性纤维增强水凝胶系统中，3D打印聚（乳酸-共聚-乙醇）酸（PLGA）支架具有良好的排列结构，可为MTJ的生理功能提供足够的机械强度；间充质干细胞的引入可增强肌肉和肌腱的促再生生物活性，Klotho的负载可改善MTJ损伤后外源性间充质干细胞和内源性MTJ驻留细胞的病理环境；此外，将光交联甲基丙烯酰丝纤维素（SilMA）水凝胶融合到 PLGA 支架中，作为输送 Klotho 的载体，并为间充质干细胞的保留和存活提供3D富水微环境。本研究首先评估了生物活性纤维增强水凝胶的理化性质和细胞相容性。随后，将水凝胶系统植入大鼠 MTJ 缺陷模型，以评估其在促进 MTJ 结构和功能再生方面的原位功效。进行了体内蛋白质组学分析，以揭示水凝胶系统促进 MTJ 再生的内在机制。根据蛋白质组学结果，进行了进一步研究，探讨通过水凝胶系统操纵细胞微环境是否以及如何调节移植间充质干细胞和常驻细胞的行为，从而促进 MTJ 再生。

【制备生物活性纤维增强水凝胶并对其进行表征】

为MTJ再生设计一种具有足够机械强度和再生生物活性的理想组织工程支架，本研究开发了一种负载间充质干细胞和 Klotho 的 PLGA 纤维增强 SilMA 水凝胶（图 1A）。利用熔融沉积建模（FDM）3D打印技术，制作了具有正交排列网格和相互连接的大孔的 PLGA 支架，为受伤的 MTJ 的力传导和组织生长提供机械和结构支持。随后，将 SilMA 前体、间充质干细胞和重组 Klotho 的混合物融合到 PLGA 支架中，并通过光交联形成具有微孔和互连结构的纤维增强水凝胶。作为间充质干细胞和生物活性分子的多功能载体，SilMA 水凝胶的引入提高了间充质干细胞的保留率，为细胞生长和营养交换建立了有利的3D微环境，并有效地充当了 Klotho 的释放系统。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，微孔 SilMA 水凝胶渗入大孔 PLGA 支架的间隙中，从而提供了有利于细胞粘附的更佳微环境（图 1B）。PLGA（PA）、SilMA-PLGA（SM-PA）和 Klotho@SilMA-PLGA （K@SM-PA）支架的 PLGA 纤维直径约为 340 μm（图 1C）。此外，SM-PA 和 K@SM-PA 支架的孔面积没有明显差异，表明 Klotho 的加入对 SilMA 水凝胶的微孔结构没有显著影响（图 1D）。对播种了间充质干细胞的纤维增强水凝胶进行的扫描电镜分析表明，间充质干细胞以球形或纺锤形形态包埋在 SilMA 水凝胶基质中。

图1 生物活性纤维增强水凝胶的制造与表征

【生物活性纤维增强水凝胶能有效促进大鼠 MTJ 的结构和功能再生】

利用大鼠 MTJ 缺损模型评估了本研究的生物活性纤维增强水凝胶对 MTJ 再生的功效（图 2A）。未经处理的 MTJ 缺损设为对照组。植入 4 周后，对 MTJ 缺损处的再生组织进行组织学检查。结果发现，术后 4 周时，残留支架占据了再生组织的一定空间，阻碍了典型 MTJ 结构的清晰呈现。因此，位于缺损处和邻近支架的修复组织被用来评估 MTJ 修复情况。血红素和伊红（H&E）以及马森三色染色显示，M@SM-PA 组和 K/M@SM-PA 组再生的 MTJ 组织显示出肌肉和肌腱纤维的广泛插入，并有明显的相互交错，而 Ctrl 组和 SM-PA 组的组织则显示出罕见、不规则和短的相互交错（图 2B 和 C）。还观察到 M@SM-PA 和 K/M@SM-PA 水凝胶比 Ctrl 和 SM-PA 支架能诱导形成更有组织的肌腱纤维，K/M@SM-PA 组的肌腱胶原纤维呈原生波浪状（图2B 和 C）。定量分析显示，与其他三组相比，K/M@SM-PA 组的肌腱组织学评分明显较低，表明其形成的组织更像肌腱（图 2G）。在再生肌肉组织方面，K/M@SM-PA 组与 Ctrl、SM-PA 和 M@SM-PA 组相比，肌纤维直径明显增加，表明 K/M@SM-PA 水凝胶促进了肌肉再生（图 2B、C 和 H）。总之，这些发现意味着生物活性纤维增强水凝胶在促进 MTJ 组织形成和重塑方面具有很高的功效。

图2 生物活性纤维增强水凝胶可促进大鼠 MTJ 的结构再生

本研究通过步态分析和机械测试进一步评估了修复后 MTJ 的功能恢复情况。步态分析是通过评估行为表型来评估 MTJ 功能的一种可行且无创的方法。如图 3A 至 C所示，使用实时荧光成像系统捕捉大鼠行走时的爪印。在指定时间点（术后 1 周、2 周和 4 周）收集大鼠爪印并对步态参数进行综合分析，包括时空参数（步长、摆动时间和摆动速度）和强度参数（平均强度、最大接触平均强度和最大接触最大强度）（图 3D 和 E）。随着疼痛程度的增加，大鼠的行走运动受到不利影响，导致除摆动时间外的所有上述参数下降。结果显示，与正常大鼠相比，术后 1 周所有组大鼠的步态均出现异常，步长和步幅明显减少（图 3F 和 I 至 K）。从第 1 周到第 4 周，这些参数逐渐接近甚至超过正常大鼠，其中 K/M@SM-PA 组的恢复最为明显（图 3F 至 K）。具体来说，术后第 2 周，K/M@SM-PA 组的步长和摆动速度值明显高于 Ctrl 组（P < 0.05）（图 3F 和 H）。此外，K/M@SM-PA 组大鼠的摆动速度值在术后 2 周已超过正常大鼠（图 3H）。在摆动时间方面，K/M@SM-PA组大鼠在术后1周和2周的摆动时间值最低，表明K/M@SM-PA水凝胶治疗后大鼠的行走运动得到了改善，但组间差异不显著（图3G）。此外，K/M@SM-PA 组的强度参数在所有组别中表现出最高水平，包括术后 4 周的平均强度、最大接触平均强度和最大接触最大强度（图 3I 至 K）。这表明，K/M@SM-PA 治疗后，大鼠的站立姿势更加稳定，疼痛减轻。总之，上述步态分析表明，在植入生物活性纤维增强水凝胶后，MTJ 的功能恢复得到了显著改善。

图3 生物活性纤维增强水凝胶促进大鼠 MTJ 的功能恢复

(责任编辑：admin)

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