3D打印PEEK颅颌面植入物成骨细胞反应
聚醚醚酮 (PEEK) 是替代骨科、脊柱和颅颌面手术中金属植入物和假体的主要候选材料。基于材料挤出工艺的电熔制丝 (FFF) 是一种经济高效的3D打印方法，用于制造PEEK植入物。在这项研究中证实具有高表面粗糙度和FFF 3D打印结构未经处理PEEK具有很大的潜力，作为一种适当的异体生物材料用于重建颅颌面手术。
来自德国图宾根大学医院医学材料科学与技术科、瑞士巴塞尔大学医院口腔和颅颌面外科以及巴塞尔大学生物医学工程系高技术研究中心医疗增材制造研究组团队发表的相关论文“An In Vitro Study of Osteoblast Response on Fused-Filament Fabrication 3D Printed PEEK for Dental and Cranio-Maxillofacial Implants”于2019年5月31日在线发表于科技学术期刊《MDPI》平台上。
论文链接：
https://www.mdpi.com/2077-0383/8/6/771/htm
对FFF 3D打印PEEK表面的分析
PEEK已广泛用于多种临床应用：用于骨折固定、颅颌面缺损修复、脊柱植入物、全关节置换术(TJA)，甚至在软组织修复中用作缝合锚。它在牙科领域的应用非常广泛，包括牙种植体、种植体支撑杆、假牙、基台和夹具。PEEK具有许多特性，使其成为替代骨科和重建手术中涉及的金属植入物部件的合适候选材料。
PEEK具有良好的生物相容性、高耐化学性、低密度 (1.32g/cm3 ) 并且具有生物惰性。其生物惰性阻碍了它的骨整合潜力，并阻碍了它的临床应用。最近的研究表明，PEEK表面的微粗糙形貌可以促进软组织和硬组织的生长。尽管在提高PEEK植入物的生物活性方面取得了很大的优势和进展，但FFF 3D打印PEEK的生物性能以及打印表面结构对细胞粘附、代谢活性和增殖的影响尚未见报道。这项研究的新颖之处不在于PEEK材料，而是FFF 3D打印PEEK表面的分析。因此，在此次研究中，研究团队使用FFF制造PEEK样品，通过抛光和喷砂对表面进行改性，以评估表面形貌和表面粗糙度对细胞粘附、代谢活性和增殖的影响。
研究所用打印机及耗材
PEEK圆盘样品（n=200，Φ=14×2mm3）使用Apium P220 3D打印机来制作。左表列出了本次研究中使用耗材对应的打印机参数。右表列出了本次研究中使用的医用级PEEK 3D丝材的物性。（Evonik VESTAKEEP® i4G树脂)。熔融的PEEK丝材通过挤出机的喷嘴挤出，并逐层沉积。一旦沉积了单层，打印机的构建平台就会根据制造所选择的层厚度向下移动，并沉积下一层。随着每一层的沉积、冷却和硬化，最终的样品就被打印出来。
研究结果
l 表面特征
图1显示了不同组的FFF 3D打印PEEK样品表面的SEM图像。由于FFF制造工艺，在未处理的PEEK样品上检测到了由明显的峰和谷组成的打印表面的分层图案（a-c）。抛光后，特定的打印线条消失，留下一个均匀、光滑的表面（d-f）。喷砂表面也没有表现出分层图案。与抛光表面相比，喷砂表面呈现出微粗糙的表面形貌，具有均匀分布和覆盖的突起和空腔（g-o）。此外，与50µm和120µm的Al2O3喷砂组相比，250µm喷砂的样品在其表面上表现出更高的微粗糙度，具有更大的突起和空腔。
图1：不同组3D打印PEEK样品表面的SEM图像
l 表面粗糙度
图2显示了重建的3D表面形貌和不同组的定量粗糙度结果。在未经处理的PEEK表面观察到FFF 3D打印结构，Ra和Rq值分别为22.28±15.26µm和26.75±17.17µm。与未处理组相比，抛光和喷砂样品的表面明显更光滑、更均匀( p<0.05)，Ra更低（抛光：0.17±0.08µm；50µm喷砂：0.28±0.13µm；120µm喷砂：0.43±0.15µm；250µm喷砂：0.52±0.38µm)和Rq（抛光：0.30±0.15µm；50µm喷砂：0.49±0.25µm；120µm喷砂：0.76±0.23µm; 250µm喷砂：0.88±0.56µm。
图2：不同组3D打印PEEK样品的重建3D表面粗糙度形貌
l 表面亲水性
通过在样品表面涂抹2µL超纯水来确定表面的亲水性。结果如图3所示。无论表面处理如何，所有组都表现出较差的润湿性。不同样品表面的接触角相似且差异较小（p>0.05，未处理样品：84.6±9.6°，抛光样品：86.5±4.4°，50µm喷砂样品：88.7±3.0°，120µm喷砂样品：88.0±2.2°，250µm喷砂样品：87.1±3.5°）。此外，与未处理组相关的标准偏差高于抛光和喷砂组。
图 3. 不同组3D打印PEEK样品的接触角测量
l 初始细胞粘附
接种成骨细胞4小时后，通过结晶紫染色分析初始细胞粘附情况。图4显示了示例样品上成骨细胞表面覆盖率和参考未经处理的PEEK的定量OD值。4小时后，不同组别的SAOS-2成骨细胞的表面覆盖率非常相似；不同的是250µm喷砂组。该组中的表现出比其他组略高的成骨细胞表面覆盖率。研究团队的定量结果证实了这一发现：与其他组相比，用250µm Al2O3颗粒喷砂的样品表现出更高的相对OD值（137±45%）（未经处理：100±10%，抛光：101±14%，50µm喷砂：107±13%，120µm喷砂：118±21%）。250µm喷砂组与未经处理、抛光和50µm喷砂组之间的存在较大的差异（P<0.05）。此外，250µm喷砂组的初始细胞粘附的标准偏差也高于其他组。
图 4：不同组3D打印PEEK样品的初始细胞粘附力测试
l 细胞增殖
为了确定FFF打印结构和表面粗糙度对成骨细胞生长的影响，研究团队用CCK-8试验来检查细胞的代谢活动，作为细胞增殖的间接测量（图5）。在5天的过程中，所有样品表面的代谢活动都在增加，表明所有组都在持续增殖。此外，与抛光和喷砂表面相比，未处理的PEEK样品表面上的细胞的CCK-8还原活性有明显增加（P<0.05）。1天后，稍高的OD值（0.69±0.07）表明，与在抛光（OD值：0.50±0.05）和喷砂表面培养的成骨细胞相比，在未处理的表面上培养的成骨细胞增殖更快（OD值：50µm组：0.59±0.12；120µm组：0.48±0.10；250µm组：0.59±0.14)。随着培养时间的增加，差异变得更加明显。与抛光和喷砂表面的细胞相比，未经处理的表面上的细胞在3天和5天后表现出更高的生长率（≈2-3倍）。
图 5：通过CCK-8试验评估不同时间点样品表面的细胞增殖
l 长期培养后的细胞密度
在播种5天后，通过用结晶紫对细胞层进行染色，确定FFF 3D打印的PEEK样品表面的细胞密度。在拍照记录之后，通过洗脱结晶紫，然后对洗脱的染色剂进行光度测量来量化成骨细胞密度。图6显示了在示例样品上长期培养成骨细胞后细胞密度的代表性例子，以及与未处理组相比，处理后表面的平均细胞密度（未处理表面的百分比）。与抛光和喷砂组相比，FFF 3D打印PEEK样品的未处理表面在5天后表现明显增强的细胞密度。此外，与喷砂样品相比，抛光样品表面的成骨细胞密度略有增加。经过长时间培养后，定量OD值证实了显微图像中的发现，即与其他组相比，未经处理的PEEK表面的附着细胞密度明显较高（P<0.05）。喷砂PEEK上的细胞比例低于抛光表面的细胞比例（P<0.05）。然而，与抛光组相关的标准偏差高于喷砂组。
图6：培养5天后不同小组的SAOS-2细胞密度
结论
研究团队通过研究表面粗糙度和润湿性、细胞粘附、代谢活性和增殖，系统地分析了FFF 3D打印PEEK的生物活性。结果表明，FFF 3D打印技术可以产生传统喷砂方法无法实现的高度粗糙表面和特殊打印结构。润湿性在初始细胞粘附中起着重要作用；随着培养时间的延长，样品表面形貌和粗糙度的影响越来越明显。与抛光和喷砂的PEEK样品相比，用FFF 3D打印的各向异性表面纹理对PEEK样品的生物活性具有刺激作用，尤其是在细胞代谢活性和增殖方面。其体外测试显示，FFF 3D打印的PEEK具有各向异性的打印结构和表面粗糙度，是一种有希望改善细胞附着力、代谢活性和增殖的材料。因此，FFF 3D打印的PEEK可以成为牙科和颅颌面植入物的潜在候选生物材料。
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