【文献分享】基于黄原胶浴悬浮3D打印致密复杂组织(2)
时间：2023-09-07 11:05 来源：3D打印致密复杂组织 作者：admin 阅读：次
三、特征打印
为了演示除直线以外的特征的3D打印，使用含有0.1 φp Fe2O3颗粒的墨水打印了大小网格图案(图4(A))。结果表明，特征可以打印重现，并且相交线引起的干扰最小。此外，通过打印一系列具有不同行距的后续线条来探索打印纸张的方法(图4(B))。当后续线的中心间距为400 μm时，可以形成可复制的薄片。较低的300 μm距离会导致颗粒过度堆积，形成不规则的片状物。较高的500 μm距离会导致扩散堆积后的后续线之间出现间隙。
图4 复杂结构打印
四、平台潜力
在本研究中所研究的所有油墨中，悬浮油墨的颗粒最初都是自由地流入喷嘴图区，然后通过扩散堆积进行集中接触，形成致密的颗粒线。海藻酸盐颗粒和胶原颗粒线随着时间的推移是稳定的。CMs、IPSCs和SMC球体随着时间的推移融合形成微组织(图5(B) - (D))。这些组织的形态根据所使用的细胞或细胞球体的融合电位而变化。主要表现为：SMC球体形成了一种刚性纤维，可以用镊子夹起(图2(C))，这一特征也可以在其他配方中观察到，包括iPSCs，以及SMCs与PLA颗粒的组合。在没有细胞的情况下，颗粒保持原位。当分别测试胶原包被颗粒与SMC细胞和SMC球体的组合时，随着时间的推移，观察到复杂组织的自组装。由于组织致密，线条特征转变为多个组织球，以初始细胞和球体浓度最高的区域为中心(图5(E)和(F))。对感兴趣的区域进行z堆叠成像，观察组织结构。这表明，细胞物质包围了颗粒，并将它们整合成一个复合组织。
Robert Passier团队还测试了不同打印喷嘴的使用，与影响打印分辨率的传统参数进行比较，表明使用较小的喷嘴对线条的平均特征分辨率只有边际影响（图5（A））。并且沿其长度改善了线宽的一致性。
五、纤维类器官的自组装
在第3.4节中，观察到细胞物质融合成纤维，这可以被认为是一个自组装过程，Robert Passier团队假设纤维可以随着时间的推移进一步重塑。
（1）荧光蛋白标定
为了验证这一点，Robert Passier团队3D打印了hpsc来源的CMs和hpsc来源的心外膜细胞系，它们都表达不同的荧光蛋白，从而可以跟踪两种细胞类型。hPSC-CMs表达来自NKX2.5基因组位点的GFP，并具有α - actiin - mrubyii融合蛋白。NKX2.5是一种心脏标志物，存在于心脏祖细胞和收缩的CMs中，α -肌动蛋白是CMs中收缩机制的一种肌合成蛋白(图6(A))。通过内源性表达COUP-TFII位点的红色荧光mCherry，可以识别打印构建体中的hpsc -心外膜细胞。COUP-TFII在心外膜细胞中表达，但在心室CMs中不表达(图6(A))。
（2）随时间形成纤维
在图6(B)中，可以观察到心脏/心外膜细胞结构在3 d内形成连接的纤维。第3天之后，纤维延长至第8天，之后纤维缩短。在细胞密度过低的位置，纤维分离成较小的细胞球体。
（3）细胞迁移
如图6(C)所示，根据第0天细胞结构内的荧光分布，打印后细胞立即随机分散。随着时间的推移，细胞逐渐在纤维结构内迁移，在13 d的时间过程中形成双层组织，由一层心外膜细胞覆盖的CMs体组成，类似于人类心脏组织中的组织。
（4）肌节形成
第13天，共聚焦显微镜检查肌节的形成，观察到纤维组织内α -肌动蛋白的均匀分布(图6(D))。
（5）组织自发与起搏跳动
第8天观察到自发性心跳。在心脏纤维电起搏后，组织开始同步跳动，起搏频率可达4hz(图6(E)和(F))。
（6）形成自发附着的组织纤维
当纤维与允许粘附的板表面接触时，观察到组织纤维的自发附着(图6(G))。
图6 心脏组织的生物打印
总结
Robert Passier团队的方法允许简单和廉价的3D打印稀颗粒悬浮液，自组装形成致密复杂的组织纤维。由于不需要水凝胶相，细胞和球体很容易融合并组织成功能结构，如跳动的心脏纤维打印图所示。黄原胶浴可以3D打印具有定义的隔间，以空间定义的模式刺激随后打印的组织。由于镀液的渗透性允许液体扩散，因此可以通过在镀液顶部添加简单的液体来引入趋化引导。如心脏纤维起搏所示，机械和电刺激在培养过程中也是可能的。最后，这种方法是廉价的，可以很容易地适应任何挤出式生物打印机。
(责任编辑：admin)
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