生物3D打印人类皮肤，同时打印6种细胞极为罕见，“数量”也是一种创新

时间：2023-11-30 08:57 来源：先进材料作者：admin 阅读：次

生物打印是一种有前途的替代方法来生产皮肤替代品，因为它可以复制皮肤的结构组织进入仿生层体外。在这项研究中，六种原代人类皮肤细胞类型被用来生物打印一个由表皮、真皮和皮下组成的三层皮肤构建体。将生物打印的皮肤与人类细胞移植到 nu/nu 小鼠的全厚伤口上促进了类似于天然人类表皮的表皮网状脊的快速血管化和形成，具有正常外观的细胞外基质。细胞特异性染色证实了植入的细胞与再生皮肤的整合。
使用类似的方法，在猪切除伤口模型中，将5厘米乘5厘米生物打印的自体猪皮移植物移植到全层伤口上。生物打印皮肤移植改善皮肤脱皮，减少皮肤收缩，支持正常的胶原组织，减少纤维化。生物印迹自体皮片移植创面的差异基因表达显示了促重塑蛋白酶活性。这些结果表明，生物打印皮肤可以支持皮肤再生，以允许非纤维化伤口愈合，并表明皮肤生物打印技术可能适用于人类临床应用。

挤压生物打印用于用人类细胞[表皮角质形成细胞，黑素细胞，真皮成纤维细胞，FDPCs，真皮微血管 EC (DMECs)和脂肪细胞]制备多层仿生皮肤结构(图1A)。将细胞悬浮于三种基于纤维蛋白原的水凝胶生物墨水中(图1B) ，并连续用层层生物墨水沉积印刷，以形成由人类皮肤，真皮和皮下组成的3cm × 3cm 三层仿生皮肤构建体(图1C)。细胞表现出正常的表型，经细胞特异性标记证实(图 S1)。在体外第7天(活细胞的77.7% ± 10.9) ，细胞活力在第13天和第21天维持在生物打印的皮肤中，细胞活力降低(分别为活细胞的58.2% ± 17.6和62.0% ± 36.9)(图1，D 和 E)

生物打印和培养4天后，将生物打印的皮肤移植到小鼠的2.5 cm × 2.5 cm 全厚度伤口中，然后进行90天(图2A)。对照组包括仅使用水凝胶的生物打印对照组和未经处理的伤口。数字图像和平面测量用于监测全伤口闭合，收缩和上皮化(图1)。S2) ，有证据表明在前面描述的早期时间点上皮化改善(20)。到第14天，所有生物打印的皮肤处理的伤口完全闭合(分别为100.0.0% 和64.1 ± 5.0% ，64.8 ± 13.9% ; P < 0.0001)(图2B)。所有三组均表现出收缩，在整个愈合过程中组间无显着差异(分别为49.6 ± 20.3% ，53.8 ± 9.7% 和54.5 ± 12.4% ; P > 0.05) ，伤口闭合时间的差异是由于生物印刷皮肤处理的伤口早期上皮化(图2C 和图2)。中二)

早期新血管生成对愈合真皮的发育至关重要，并为长期伤口愈合提供必要的营养。人类皮肤(图3A)和生物打印皮肤(图3B)免疫荧光染色显示具有人 CD31阳性 EC 的内层(绿色)和 CD146阳性周细胞的外层(红色)的血管腔，表明植入的人 EC 参与形成新生血管冠状动脉在再生皮肤和成熟通过招募宿主小鼠周细胞。或者，天然小鼠皮肤，水凝胶和仅伤口对照每个显示只有少数 CD146阳性周细胞和没有人类 CD31阳性细胞(图3C)。用 CD146(图3D)和 H & E 染色(图3E)对毛细血管进行免疫检测，以定量90天内愈合伤口的血管状况。与对照水凝胶和未处理的伤口相比，生物打印的皮肤处理的伤口显示出显着更大的血管密度(24.7 ± 3.8,17.8 ± 3.0,13.7 ± 3.4; P < 0.0001; 图3F 和图。S4) ，并且由比水凝胶和未处理的对照更小(< 500μm)和中等大小(500至1000μm)的毛细血管组成(图3G)。在第42天也出现了类似的趋势，到第90天，所有组的血管大小分布和密度都正常化了(图1)。

临床翻译的下一步是将该技术推广到一个明确的临床前猪创伤模型(图5A)。从皮肤和颈动脉活组织检查(图5，B 和 C)分离自体球菌素角质形成细胞，成纤维细胞，EC 和前脂肪细胞，并在体外扩增28天。同种异体皮肤细胞平行培养。虽然成功地从活检组织中获得细胞并扩增，但所有细胞类型的成功分离和培养在跨治疗组和动物中并不一致(表 S2)。

H & E (图6A)和 Masson 三色(图6B)染色显示，与生物打印的移植物和仅水凝胶对照相比，生物打印的自体移植物中表皮厚度和原始脊的存在增加。Picrosirius 红色染色显示，生物打印的自体移植物具有与未受损猪皮相似的红/黄/绿纤维染色比率，并且具有相似的篮状编织细胞外间质(ECM)组织，与生物打印的同种异体移植物和仅水凝胶处理的伤口中的平行的纤维化组织相比，强烈的红/黄染色的 ECM (图6C)(13)。免疫荧光染色显示在生物打印的自体移植物中表皮成熟改善，具有几个强大的 KRT14 + 基底角质形成细胞和愈伤组织蛋白(IVL) + 浅表角质形成细胞层(图6D，顶行)。IVL 和波形蛋白染色的进一步研究显示，与生物打印的自体移植相比，对照组的纤维母细胞性增加(图6D，底部行)。

这项研究的发现受到使用小型和大型动物模型的限制，这些动物模型可能不能完全概括人类伤口愈合。对于松弛的皮肤 nu/numouse 模型尤其如此，在这种模型中，伤口更有可能通过收缩而不是上皮化来关闭。这项工作也是有限的技术转化为人类使用。阻碍翻译的一个关键挑战是细胞分离和扩增的挑战。本研究中自体猪生物打印皮肤的生产允许创建自体纤维化和扩张的标准操作程序，生成生理细胞密度(大于10 × 106个细胞/ml 生物墨水)的打印皮肤所需的数百万个细胞。通过产生大约5 × 106个细胞/平方厘米的皮肤活检，我们能够在28天内产生全厚皮肤从9到25平方厘米增加的表面积，没有啮合。

在临床上，这一步骤可以通过在病人初次出现时进行小型穿刺活组织检查来完成，以便有足够的时间进行细胞扩增。细胞分离和扩增的过程将需要用自动化组织过程进行优化，以充分实现这种技术的潜力，包括增加细胞产量，自动化细胞培养减少污染，以及评估移植和伤口再生功效的最低必要细胞。

总之，具有多种细胞类型的生物打印人皮肤构建体能够促进和加速小鼠全层创面的愈合。生物印迹猪自体移植物通过再上皮化和减少收缩改善了猪全层伤口的愈合。这种愈合过程导致了非纤维化胶原重塑。这些发现表明，细胞增殖的移植物支持伤口愈合，自体细胞进一步支持非纤维化表皮和真皮再生。总之，我们的研究结果表明，生物打印自体皮肤迅速整合到伤口中，以支持皮肤再生，并提出了皮肤生物打印技术治疗全厚度伤口的可能性。

原文：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adf7547

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