3D打印微针阵列贴片可用于小分子、蛋白质和核酸等液态固态皮内给药

时间：2024-10-15 08:22 来源：EFL生物3D打印与生物制造作者：admin 阅读：次

        自20世纪70年代以来，微针阵列贴片(MAP)一直是微创药物输送和诊断的有前途的平台。传统上，MAP由放置在聚合物背衬上的均匀分布的微米级针头阵列组成。这些微针可以刺穿角质层，进入皮肤的表皮层和真皮层，而不会到达神经，从而实现无痛的皮内(ID)治疗。近日，来自斯坦福大学的Joseph M. DeSimone/北卡罗来纳大学的Jillian L. Perry团队利用高分辨率3D打印制备了一种新型格状MAP (L-MAP)结构。与传统模制和固体涂层MAP相比，L-MAP可以用每个贴片更少的针头装载更多货物，从而增强货物装载和药物输送能力。此外，L-MAP可以成为相关治疗货物（小分子、蛋白质和核酸）的液态和固态输送的平台技术。
相关研究成果以“3D-Printed Latticed Microneedle Array Patches for Tunable and Versatile Intradermal Delivery”为题于2024年9月2日发表在《Advanced Materials》上。
1.网格微针阵列贴片(L-MAP)库的系统设计
       为了设计L-MAP，系统地改变了针基形状（三角形、正方形、五边形、六边形和圆形）、针中格子层数（1、2和3）以及支柱的锥形尺度等变量（图1A）。锥形尺度是指每个支撑支柱从基部到尖端的锥形程度，如图1A所示，锥形尺度越大，最小支柱宽度和最大支柱宽度之间的差异就越大。这三个关键变量的组合用于生成不同L-MAP设计组。使用这种设计策略，生成了43个L-MAP设计，并从计算机辅助设计(CAD)文件中计算出空隙体积和支柱表面积（图1B）。该策略用于探索一系列针头表面积和空隙体积，以分离具有不同货物释放动力学的设计。
      为了设计机械完整性（MI）评分，将针头体积中具有高安全系数 (>6) 的百分比最大化，同时将其预测的最大von Mises应力(GPa)和尖端变形最小化。使用5个样本L-MAP设计验证了开发的MI评分系统，并根据MI评分以经验方式评估了它们的抗压强度。有三种L-MAP设计的MI评分高于10，而其他设计的MI评分则低一个数量级(图1C)。根据库设计和计算机模拟的数据，选择了最佳L-MAP设计，以便根据图1D中概述的工作流程进行下游表征并与方形底座实心针状MAP进行比较。

图1 生成L-MAP设计库

2.L-MAP设计的制造和机械特性
随后，作者对三种下选的L-MAP设计进行了优化，以便在Carbon 3D开发的工业化高分辨率CLIP原型打印机上进行打印。该研究成功在10分钟内打印出每个补丁的L-MAP（打印尺寸= 5 mm × 8.2 mm × 2 mm），并拍摄了针头的SEM图像以显示针头的形态和拓扑结构（图2B）。每片贴片有40根针头的L-MAP设计在Instron装置上进行了压缩测试，以评估失效力和失效模式（图2C）。所有针头均因屈曲而非断裂而失效，这对于避免残留针头碎片留在用户皮肤中的危险非常理想。所有这些失效力均大于每根针∼0.1 N，这是穿透皮肤所需的平均力（图2D）。使用光学相干断层扫描(OCT)评估L-MAP在切除的人体皮肤中的穿透深度（图2E）。总体而言，与实心MAP 相比，这三种L-MAP设计在人体皮肤中的平均穿透深度都更高（图2Eii）。

图2 最佳L-MAP设计的3D打印和机械特性

3.L-MAP的固态和液态小分子输送
为了证明该平台在小分子固态和液态输送中的实用性，作者选择了亚甲蓝染料作为模型货物。对于固态货物装载，将贴片浸涂在 0.5 wt/v% 亚甲蓝染料和粘度/稳定性增强赋形剂（甲基纤维素和蔗糖）的混合物中。浸涂后，将贴片在室温下风干1小时（图3Ai）。一般而言，与尺寸相似的固体MAP相比，L-MAP的货物装载量至少增加了2倍，其中Sq 2 Tier L-MAP设计可容纳最多的货物（图3Aii）。固态货物装载量也可以通过增加MAP浸涂层的数量来增加。此外，L-MAP设计的货物装载在第三次浸涂后达到稳定状态。因此，对于后续的固态货物输送特性，所有MAP每个贴片都进行了3次浸涂。对于液体输送，使用类似的浸涂策略，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将0.5 wt/v% 亚甲蓝染料装入贴片，并量化装载的液体染料量（图3B）。从光学显微镜图像中可以看出，L-MAP能够将液体货物的液滴截留在空隙中，而固体MAP则无法捕获任何液体制剂（图3Bi）。

在水合的、切除的猪皮中评估了每种L-MAP设计的小分子染料输送动力学。贴片上装有0.5 wt/v% 亚甲蓝染料（固态或液态），并在指定的应用时间内应用于猪耳皮肤活检。取下贴片后，获得了输送到皮肤的染料量，相对于贴片上剩余货物的百分比。该方法用于评估固态（图3C）和液态（图3D）小分子制剂的货物输送动力学。考虑到液体货物的运送，仅评估了L-MAP的释放曲线，因为液体货物无法被固体MAP有效捕获。正如预期的那样，固态运送的释放动力学与液态不同（图3C、D）。对于固态货物运送，Pent 2 Tier和Sq 3 Tier设计似乎具有相似的释放动力学，45%的货物在5分钟内释放。Sq 2 Tier设计似乎以稍慢的方式释放货物，5分钟内只有38%的货物运送。最后，固体MAP释放货物最快，5分钟内货物运送率为56%。

此外，作者还观察到液体货物的释放动力学随L-MAP设计的不同而不同，其中Sq 2 Tier 贴片可提供最快、最高效的货物输送。超过85%的货物在5分钟的应用时间内输送（图3D）。综合以上数据可知LMAP可用于将固态和液态小分子有效载荷有效地输送到皮肤，具有不同的释放曲线。

图3 固态和液态、小分子染料输送的动力学

4.使用L-MAP进行固态卵清蛋白(OVA)输送
蛋白质抗原递送在疫苗领域备受关注，并且已经证明卵清蛋白(OVA)通过MAP递送是一种有前途的蛋白质抗原和蛋白质治疗替代品。因此，作者选择使用之前报道过的固态OVA蛋白配方，通过L-MAP展示可调节的释放动力学（图4A-B）。为了展示不同的释放曲线，选择了用不同荧光团（Texas Red 和 AlexaFluor 488）标记的OVA蛋白。首先，在切除的猪皮中评估了每片贴片一个针头设计L-MAP（Sq 2 Tier 或 Pent 2 Tier）的释放曲线。使用SEM和荧光显微镜验证分离的Texas Red标记OVA在 Sq 2 Tier针头上的装载情况和AlexaFluor 488标记OVA在Pent 2 Tier针头上的装载情况（图4C）。在离体猪皮中证实了单个贴片观察到的趋势，其中Sq 2 Tier几何形状再次比混合L-MAP上的Pent 2 Tier几何形状释放货物的速度更快（图4Di）。去除贴片后，用胶带剥离皮肤，以量化L-MAP部署期间沉积在皮肤表面的货物量。再次观察到，皮肤表面沉积的货物量极少（<4%），时间点之间没有显著差异（图4Dii）。通过切片组织进一步验证了这些结果，以可视化每个荧光团标记的OVA蛋白的荧光信号深度。

验证了不同的释放动力学曲线后，将混合L-MAP应用于大鼠，时间为10 分钟、30分钟、1小时或4小时（图4Ei）。一般来说，荧光信号可持续长达24小时，大多数信号在移除贴片后48小时消失（图4Eiii）。与Pent 2 Tier部分相比，混合L-MAP的Sq 2 Tier部分还在更短的时间内释放了更高百分比的OVA货物，这进一步证实了在离体猪皮中观察到的结果（图4Di）。以上数据表明混合L-MAP可以实现同一类型货物的不同释放曲线，并且L-MAP 系统可用于递送固态OVA蛋白。

图4 L-MAP OVA蛋白质输送具有不同的释放动力学

5.使用L-MAP进行液态mRNA递送
随着COVID mRNA疫苗的推出，液态mRNA疫苗在疫苗递送领域也获得了关注。为了证明L-MAP平台在体内皮内液体递送中的实用性，作者选择了封装在D-Lin MC3脂质纳米颗粒(LNP)中的萤火虫荧光素酶(FLuc)mRNA作为治疗相关的模型货物。Sq 2 Tier 设计被选为RNA递送，因为它具有高空隙率和液态递送的快速释放特性（图3D）。40针Sq 2 Tier L-MAP每贴片可装载约850 ng FLuc mRNA，每针可装载20 ng（图5A）。这种RNA装载能力与传统的可溶解和涂层MAP系统相当，但每贴片所需的针头数量大约是后者的一半（图5B）。

为了证明可重复的RNA递送和转染，作者采用了活体切除猪皮肤模型证明了Sq 2 Tier L-MAP可以递送货物并引发局部细胞转染。在短短1分钟的应用时间内就观察到了FLuc蛋白表达（图 5Ci）。此外，递送了两剂量的mRNA，分别为0.4 μg和0.8 μg，并显示出L-MAP的剂量依赖性。无论贴剂应用时间长短，从较高RNA剂量观察到的发光信号始终高于较低剂量的发光信号（图5Cii）。这表明，只需改变装载溶液中货物的浓度即可控制递送剂量。然后通过L-MAP将FLuc mRNA LNPs注入活体动物体内。将载有液体mRNA LNP 的L-MAPs应用于大鼠5分钟或1小时，并使用空贴片作为阴性对照（图5Di）。通过评估贴片上剩余的RNA，确定在短短5分钟的应用时间内，大约50%的装载液体货物已经释放（图5Dii）。在更长的应用时间（1小时）实现了75%的货物输送。与现有的 RNA MAP 系统相比，输送效率大约高出两倍。

此外，在所有使用液体FLuc mRNA 输送的Sq 2 Tier L-MAP中都观察到了稳健的转染和蛋白质表达（图5Diii）。早在去除贴片后3小时就观察到发光信号，去除L-MAP后24小时达到峰值，72小时减弱，显示出典型的mRNA组织转染特征（图5Div）。通过这些结果，证明了L-MAP液体RNA在大鼠中的高效和可重复性递送，并因此实现了强劲的蛋白质表达。

图5 Sq 2 Tier L-MAP可运送液体RNA货物并转染细胞

在这项工作中，作者利用高分辨率打印机来扩展L-MAP的多功能性和可调性，并运送大量固态和液态货物。所设计的新型L-MAP结构带有锥形支柱，可以帮助保持更大的空隙体积，同时在晶格针头内提供机械完整性。此外，L-MAP可以成为相关治疗货物（小分子、蛋白质和核酸）的液态和固态输送的平台技术。这项工作有望将药物输送（尤其是多种有效载荷的输送）扩展到皮内空间。L-MAP平台引入的模块化为多种有效载荷开辟了药物递送方案。然而，一个潜在的限制是确保在更短的佩戴时间内实现更高的递送效率。希望通过整合可以产生快速、高效递送方案的设备设计元素，扩展这项工作，以在未来的研究中展示L-MAP的治疗潜力。

文章来源：

https://doi.org/10.1002/adma.202404606

(责任编辑：admin)

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